mrna是蛋白质翻译的模板 详细解读：mRNA帽子结构的生物学功能与应用

1970 年代发现了信使核糖核酸 (mRNA) 的 5' 端帽 (m7GpppN)。它的存在赋予 mRNA 稳定性并实现高效翻译。随着COVID-19在全球肆虐，mRNA疗法已成为生物医药研发领域的一颗“新星”。我们进一步探索了mRNA 5'端帽结构的生物学功能和应用。

在真核细胞中，5'端帽结构除了识别蛋白质合成的起始外，还作为5'到3'核酸外切酶切割的保护基团，也募集蛋白质因子进行前体mRNA剪接。作为多聚腺苷酸化和核输出的唯一标识符，它还可以作为招募起始因子的锚点。

在病毒与固有免疫的博弈中，即使是5'端帽结构也极为重要。由于先天免疫系统对没有 5' 帽结构的 RNA 具有高度敏感性，因此许多病毒已经进化出丰富多样的加帽策略。对这些病毒mRNA加帽机制的研究，开发了高效的体外RNA加帽系统和mRNA自扩增技术，极大地促进了科学和治疗性mRNA的规模化生产。此外，RNA 加帽酶的应用也使得微生物转录组的测序和量化成为可能。

图1. mRNA的分子生物学结构

mRNA 是指导蛋白质合成的模板和遗传物质的临时副本。它具有拷贝数少、寿命短、修改元件少等特点。成熟真核mRNA的主要序列为编码区（图1），非编码区上游5'侧和下游3'侧分别含有帽结构和poly(A)尾结构（图1）） 2）@) >。

真核生物中mRNA的加帽过程需要多种加帽酶的参与。如图3所示，RNA三磷酸酶（TPase）从5'-三磷酸中去除γ-磷酸生成5'-二磷酸RNA（反应1）。RNA鸟苷酸转移酶（GTase）通过赖氨酸-GMP共价中间体转移GMP 基团从 GTP 到 5'-二磷酸（反应 2.1 和 2.2）@>。嘌呤-N7 甲基转移酶（鸟嘌呤-N7 MTase）在鸟嘌呤的 N7 胺上添加一个甲基cap 形成一个基本的帽结构（Cap0） (reaction 3）.

此外，m7G特异性的2'O-甲基转移酶（mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase）也可以将核糖2'O位置的核糖核苷酸甲基化形成Cap1结构（反应4）。*近的研究表明， Cap1 不仅与翻译起始有关，而且还是先天免疫系统中针对外来 RNA 的自身 RNA 的标志物。

图2. 真核生物中mRNA的帽结构类型

图3. 真核生物中的mRNA加帽过程

5'帽结构在mRNA的质量控制中起着至关重要的作用。据报道，在哺乳动物细胞中，存在具有脱帽酶、焦磷酸水解酶和 5' 到 3' 核酸酶活性的三功能蛋白 DXO/Dom3Z。该酶特异性地将未甲基化的帽结构（GpppN）脱帽，将其降解为5'-单磷酸RNA，从而达到质量控制的目的。

5'帽结构有助于调节蛋白质合成。在早期，人们认为 RNA 加帽只发生在细胞核中。据报道，在哺乳动物细胞和锥虫的细胞质中发现了 RNA 加帽。真核细胞在 P 体中以信使核糖核蛋白 (mRNP) 的形式维持未加帽的 mRNA 细胞质池，在那里可以发生 mRNA 储存、去腺苷酸化和脱帽。P-body 中未加帽的 mRNA 可以重新进入 polysome 并被翻译。细胞质重述结构可能代表了一种新的 mRNA 失活-再激活机制，有助于调节蛋白质合成。

鉴于 RNA 帽结构在蛋白质翻译和先天免疫中起着重要作用，病毒已经进化出一种生物系统，其中 RNA 添加帽结构以合成病毒蛋白质并逃避宿主细胞的先天免疫系统。由于大多数细胞中的 RNA 加帽位点在细胞核中，因此在细胞质中复制的病毒会产生自己的 RNA 帽结构。它们要么合成自己的 RNA 帽结构，要么直接从宿主的 mRNA 中获取。

一些病毒加帽酶整合了 RNA 加帽（多功能加帽酶）所需的所有酶活性，以在单个多肽中生成 Cap0 或 Cap1。痘病毒加帽酶和蓝舌病毒加帽酶就是两个这样的例子，它们的全长蛋白质结构已经解析（图4）：

图4.痘病毒加帽酶和蓝舌病毒加帽酶结构

痘病毒加帽酶结构和生化数据表明 D12 与鸟嘌呤-N7 MTase 结构域的相互作用诱导了有效催化所需的构象变化。痘病毒加帽酶的三种酶活性从 N 端到 C 端按照 TPase、GTase 和 Guanine-N7 MTase 的顺序整齐地排列成离散的模块。蓝舌病毒加帽酶 VP4 整合了所有四种酶活性以生成 Cap1 结构。

病毒除了合成自身的帽结构外，还夺取宿主的mRNA帽结构（图5）。在流感病毒（（-）ssRNA）中，依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp）是三种蛋白质的复合物：聚合酶碱性蛋白 1（PB1），聚合酶碱性蛋白 2（PB2）@> 和聚合酶酸性蛋白 (PA)）。

在细胞核中组装后，PB2 亚基与宿主 RNA 的帽结构结合。PA 核酸内切酶将切割包括宿主 mRNA 帽结构在内的 10-15 个核苷酸，然后将其用于病毒 mRNA 的转录。在酵母全病毒中，Gag 蛋白从宿主 RNA 上切割 m7GMP 基团并形成组氨酰-m7GMP 共价中间体。然后 m7GMP 基团被共转录并转移到病毒转录物的 5'-二磷酸。这一过程与经典 GTase 活性的相似性表明，整个病毒的帽结构与真核生物的加帽机制之间存在进化联系。

图5. 病毒直接获取宿主的帽子结构

病毒因其添加 mRNA 帽的特殊方式而受到关注。人们还发现他们的 RNA 加帽酶具有广泛的应用：

1. 外源mRNA技术

作为蛋白质合成的模板，将mRNA导入细胞是驱动细胞内靶蛋白表达*直观的方式。外源 mRNA 在干细胞重编程、疫苗接种和治疗蛋白的表达中起着关键作用。

2. 功能性mRNA的酶促合成

为避免携带动物或病毒材料，*好在体外使用非动物来源的材料，以酶促产生治疗性 RNA。通常，依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶将含有启动子的 DNA 模板转录成 RNA。RNA 的酶促加帽通常使用痘病毒加帽酶进行，该酶允许对 RNA 进行完全加帽以产生具有 Cap0 的 RNA。

在先天免疫反应*小化的应用中，可以使用帽特异性 2'O-甲基转移酶将 Cap0 结构进一步修改为 Cap1。在转录中分别使用 m5CTP 和假尿苷三磷酸代替 CTP 和 UTP，已被证明可以降低 TLR 诱导的免疫反应。

3. mRNA 疫苗

与传统的减毒活的完整生物体相比，通过 mRNA 疫苗接种的疫苗接种具有许多积极的属性。mRNA疫苗不仅不会对载体产生免疫反应，而且是刺激先天免疫和体液免疫的有效手段。制造非常简单，一旦获得致病因子的基因组序列，就可以迅速做出反应。与DNA疫苗不同，由于mRNA疫苗可以在细胞质中直接翻译，因此产生抗原的反应时间更快、更有效。无需担心潜在的基因组整合。

4. 自扩增 mRNA

使用 alphavirus 的 RNA 转录加帽装置，已开发出一种自扩增 mRNA 技术作为疫苗接种的原位基因表达载体。Alphavirus 有一个 (+) ssRNA 基因组，它编码用于 RNA 依赖性 RNA 复制、转录和加帽的非结构前体蛋白 nsp1-4，以及两个衣壳蛋白 E2 和 E1。

通过用靶基因替换衣壳蛋白基因，加帽和聚腺苷酸化的自扩增 RNA 构建体在引发免疫反应方面比通过标准 mRNA 接种疫苗更有效，并且已在动物模型中被证明是有效的。

5. Capable-Seq RNA 测序

痘病毒加帽酶可以使用 3' 修饰的 GTP 为 RNA 添加帽结构。因此，出现了一种基于该功能的从生物样品中富集和确定 5'-三磷酸 RNA 种类的新方法。称为 Cappable-seq，痘病毒加帽酶用于使用 3'-脱硫生物素 GTP 来加帽生物样品中 RNA 的 5'-三磷酸或二磷酸末端。然后可以对脱硫的生物素化加帽 RNA 进行富集和深度测序。

Cappable-seq 实现了初级转录本的 50 倍富集，并在整个基因组中以单碱基分辨率在大肠杆菌中鉴定了一个以前未报告的转录起始位点 (TSS)。该方法还被应用于从小鼠盲肠样本中鉴定微生物组转录组mrna是蛋白质翻译的模板，并首次在微生物组中鉴定出 TSS。

当前现有的封顶方法：

1.酶法mRNA加帽

痘苗病毒加帽酶在RNA的5´端添加7-甲基鸟苷帽结构（m7Gppp，Cap0）。在真核生物中，该结构与mRNA的稳定性、转运和翻译密切相关。该系统通常包含三种酶（RNA三磷酸酶、鸟嘌呤转移酶、鸟嘌呤甲基转移酶）；它们都是添加完整的Cap 0结构m7Gppp5'N所必需的。近岸蛋白生产的加帽酶可以使用T7 RNA聚合酶生产的RNA的加帽反应， GMP级（GMP-E121，Novoprotein）反应，加帽反应在一小时内完成，加帽效率接近100%mrna是蛋白质翻译的模板，所有帽结构都按正确的方向添加。这与共转录法添加不同帽类似物。

2.帽结构类似物的共转录和加帽

抗抗帽结构类似物 (ARCA) [抗抗抗帽结构类似物 3'-O-Me-m7G(5') ppp(5')G] 是用于共转录加帽的首选帽结构类似物. 由于 ARCA 是针对共转录的，N7-甲基鸟苷位于 [m7G(5')pppG-RNA] 的末端，因此它可以产生 100% 可翻译的加帽转录本。

标准帽结构类似物[标准帽结构类似物m7G(5')ppp(5')G]可以在两个方向整合[m7G(5')pppG-RNA]或[G(5')pppm7G-RNA]产生转录本作为混合物。如果帽结构类似物以错误的方向掺入到 mRNA 中，它就不能被有效翻译，导致目标蛋白的产量低。如果RNA产物是5'-加帽和5'-三磷酸的混合转录产物，则需要纯化或用磷酸酶处理，以避免5'-三磷酸RNA的免疫原性。

3.Cap 1 装饰

研究表明cap 1结构可以提高mRNA的翻译效率，从而增加mRNA在转染和显微注射实验中的表达。以近岸蛋白为例，其 Cap 1 Capping System 可以使用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，对加帽的 RNA（cap 0） 获得 cap 1 结构）进行甲基化。

综上所述，mRNA的帽结构与RNA的质量控制和机体的先天免疫有着重要的关系。同时，与加帽相关的病毒加帽相关酶也受到关注。加帽酶在外源mRNA技术、功能性mRNA的酶促合成、mRNA疫苗、自扩增mRNA和Cappable-Seq RNA测序等方面具有良好的应用前景。

参考文献：AnandRamanathan, G. Brett Robb, Siu-Hong Chan, mRNA capping: biofunctionals and Applications, Nucleic Acids Research, Volume 44, Issue 16, 19 September 2016, Pages 7511–7526,